TROMBOMODULINA RECOMBINANTE

Caracterización de la trombomodulina, un anticoagulante natural

Lic. Zuleidys Rodríguez Rivero1

RESUMEN

Durante el desarrollo de enfermedades tromboateroscleróticas se producen daños en el endotelio vascular los que están relacionados con el incremento en sangre de determinadas sustancias, consideradas como marcadores. La Trombomodulina es uno de estos, sus elevados niveles plasmáticos pudieran ser un indicador del desarrollo de fallas funcionales en el endotelio vascular. En este trabajo, se presentan algunos aspectos que caracterizan a la Trombomodulina, lo que permite mantener informados a los profesionales relacionados con la temática. Se reporta a modo de síntesis la localización de dicha molécula, su aislamiento y purificación, modo de detección, características estructurales y funcionales. También se hace referencia a la obtención de derivados de la Trombomodulina y su aplicación en el tratamiento, así como la prevención de enfermedades tromboateroscleróticas.

Descriptores DeCS: TROMBINA; PROTEINA C; PROTEINAS DE LA MEMBRANA; CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO; CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD; TROMBOMODULINA.

La trombomodulina (TM) es una glicoproteína asociada a la membrana de las células vasculares y juega un papel importante en el mecanismo de tromborresistencia.1 Fue descubierta en 1981 por C.T. Esmon y W.G. Owen,2 a partir de células endoteliales vasculares de pulmón de conejo, como un cofactor proteico que influye notablemente en la activación de la proteína C mediada por la trombina, la última serinproteasa de la cascada de coagulación.

Un año después fue purificada por C.T. Esmon y otros.3 La TM humana fue inicialmente purificada a partir de placenta humana por H.H Salem y otros4 en 1984 y su estructura genética se identificó en 1987 por Suzuki y otros.5

Localización

La TM es una proteína que se encuentra en las membranas de las células endoteliales de arterias, venas, vasos capilares y vasos linfáticos, aunque la podemos encontrar en casi todos los órganos, excepto en el cerebro, particularmente abunda en el pulmón1-3 y placenta.4 La TM ha sido localizada en plasma y orina,6-8 pero en una forma modificada con respecto a la TM de tejido ya que pierde los dominios citoplasmáticos y de transmembrana, aunque no está claro su papel fisiológico, se supone que esta TM soluble puede ser derivada de un corte proteolítico9 de la TM de transmembrana a partir de células endoteliales y liberada en cantidades de trazas a la circulación sanguínea.

Aislamiento y purificación

No es fácil obtener cantidades significativas de la glicoproteína nativa. Hasta el momento ha podido ser purificada solo en pequeñas cantidades por un proceso de múltiples pasos que involucra la cromatografía de intercambio iónico y cromato-grafía de afinidad en la cual la trombina inactivada se inmoviliza en una matriz de agarosa.3 Su purificación además es complicada porque la TM se une estrechamente por el dominio de transmembrana a las membranas de las células endoteliales, es relativamente estable a desnaturalizantes y detergentes y pierde suficiente solubilidad para ser usada en la clínica como agente antitrombótico exógeno.

Ensayos

Con el objetivo de realizar algunos estudios clínicos específicos10-12 han sido reportados ensayos para medir TM. Entre ellos se encuentra el de activación de proteína C con empleo de un cromógeno para medir actividad enzimática de la trombomodulina y el inmunoensayo enzimático por el método del sandwich; se usan dos anticuerpos de trombomodulina humana para medir su concentración plasmática.10,13,14

El desarrollo y uso de anticuerpos monoclonales15,16 es el más conveniente para diseñar inmunonensayos específicos con el propósito de medir formas solubles de TM en plasma10,11,17 sin embargo estos inmunonensayos son estrictamente dependientes de las características de los anticuerpos usados, su aditividad y su reactividad para reconocer epítopes en las moléculas de TM así como de los materiales estándares usados para la calibración.

Características estructurales

Gen de la trombomodulina

El genoma humano contiene solamente una simple copia del gen de la TM, el cual ha sido localizado en el cromosoma 20 del hombre y no contiene intrones.5,18,19 Esta información ha permitido la determinación de la estructura básica de la TM humana. Los estudios muestran que esta glicoproteína se sintetiza como una proteína de 575 aminoácidos incluyendo una región de péptido señal cuyo tamaño es de 16, 18 ó 21 residuos de aminoácidos.18,20 Si se sigue la porción del péptido señal, la TM posee consecutivamente a partir del amino terminal los siguientes dominios o regiones:

  • Un dominio amino terminal al de la lectina orientado hacia la luz vascular (223-226 a.a)
  • Seis estructuras homólogas a la presente en el factor de crecimiento epidérmico (236-240 a.a)
  • Región rica en Serina/Treonina la cual tiene muchos posibles sitios de Oglicosilación (34-37 a. a)
  • Región de transmembrana (23-24 a.a)
  • Dominio citoplasmático (36-38 a.a)

La molécula de trombomodulina

El peso molecular de las formas nativas de TM estimado por electroforesis en geles de poliacrilamida es respectivamente entre 71 KD y 105 KD, antes y después de la reducción.10 En particular la TM de placenta humana es glicosilada con un peso molecular aproximado de 105 KD en presencia de un agente reductor y 75 KD en ausencia de este. Las formas solubles obtenidas como productos de degradación tienen por lo regular menor peso molecular que las formas nativas. Las especies solubles de mayores tallas presentes en sangre han sido descritas con un peso molecular de 105 y 85 KD. El resto tienen pesos moleculares de 56, 33, 31 y 28 KD.11

La TM presenta carbohidratos enlazados covalentemente al esqueleto proteico. Esta cadena de azúcares puede tener residuos de condroitina, que se unen a la proteína en una porción donde esté presente la secuencia Ser-Gly, estas posiciones son 452, 482, 490, 492 y 515.

La TM de placenta humana tiene una estructura molecular semejante al receptor de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), aunque con diferentes regiones que determinan su función.12 También presenta gran similitud con la TM de conejo en cuanto a composición proteica y peso molecular.12,21 Su región hidrofóbica (transmembrana) requiere la presencia de detergentes para permanecer solubles en el medio y contiene 5 sitios de glicosilación localizados en la zona rica en residuos de Serina y Treonina. La TM es muy resistente a las agresiones del medio, permanece estable a pH entre 2 y 10 unidades, y su actividad no se afecta en solución de guanidina 6 M y urea 10 M, es resistente a la ebullición. Sin embargo medios que contienen pepsina y b -mercaptoetanol destruyen su actividad, lo cual indica que la estructura secundaria es importante para su funcionalidad.1 Tiene un punto isoeléctrico de alrededor de 2,5 unidades, por lo que se considera como una proteína ácida.21

Función

La TM no está sólo involucrada en el aclaramiento de la trombina a partir de la circulación, es también extremadamente activa en la regulación de la extensión de trombos.22 Esta glicoproteína es un receptor que internaliza a la trombina por endocitosis, en lo fundamental por vía de vesículas no revestidas con clatrina. Esta función es muy eficiente en dicho receptor, incluso cuando contiene el dominio citoplasmático lo cual sugiere que deben existir regiones alternativas de la molécula que medie las señales necesarias para la internalización.23 Cuando la TM se une a la trombina se forma un complejo 1:1, que tiene una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 0,4 nM.24 Bajo este efecto la trombina modifica sustancialmente sus características físicas y propiedades funcionales. La trombina en el sistema de coagulación convierte el fibrinógeno en un gel de fibras de fibrina, la cual forma el coágulo. Además la trombina activa las plaquetas y convierte a los factores de coagulación V y VIII en sus formas activadas, factores Va y VIIIa.3,25,26 La trombina sola activa la proteína C pero muy lenta e ineficientemente.26 En contraste la trombina en el complejo 1:1 con TM no forma el coágulo de fibrinógeno, no activa plaquetas4 y no convierte los factores de coagulación V y VIII en sus formas activadas.26

La TM tiene 2 efectos diferentes de inhibición de la coagulación. Uno anticoagulante como el de la heparina donde la unión TM-trombina inhibe la capacidad de la trombina de convertir enzimáticamente el fibrinógeno en fibras de fibrina, este es el efecto más común que se observa.27 El segundo producido por el complejo es la conversión del zimógeno de la proteína C en una proteína C activada a concentraciones fisiológicas de calcio, de tal modo que la velocidad constante de activación de la proteína C aumenta 20 000 veces.26 Los iones calcio unidos al dominio Gla (gamma-carboxiglutámico) de la proteína C, favorecen la interacción de esta con el complejo TM-trombina a una concentración de iones calcio de 25 mM.28 Los fosfolípidos de carga negativa son considerados como potenciadores de la actividad de la TM.29 La proteína C activada es agente antitrombótico con un índice terapéutico más confiable que otros anticoagulantes, tiene la capacidad de hidrolizar enzimáticamente los cofactores Va y VIIIa, e inhibe sus actividades en el proceso de coagulación. Con la presencia de la proteína S, la velocidad de activación de los cofactores Va y VIIIa mediada por hidrólisis, es aumentada 25 veces comparada con la hidrólisis en ausencia de la proteína S. El mecanismo de acción de la TM es uno de los más importantes que operan en el endotelio vascular para mantener el estado anticoagulante normal de la superficie del endotelio.26

Trombomodulina, marcador de daño endotelial

En varias enfermedades se produce una liberación acelerada de TM a partir de células endoteliales como consecuencia de la actividad proteolítica generada en sus superficies. Un aumento considerable de TM soluble, ya sea en plasma o en orina, está relacionado con daños en las células endoteliales e indica la presencia de disfunción renal. La TM es considerada como un marcador de vasculitis y de destrucción de células endoteliales.

Existen numerosas patologías donde se alteran los niveles de TM. Entre ellas podemos citar la aterosclerosis coronaria, las enfermedades arteriales oclusivas periféricas, la hiperhomocistinemia, la diabetes tipo I con microalbuminuria, los procesos inflamatorios, fallos crónicos renales, malaria, enfermedades del colágeno (lupus eritematoso, esclerosis sistémica artritis reumatoides, etc.), procesos sépticos, angiitis, daño pulmonar (asma), entre otras.30

Derivados de trombomodulina

La molécula se retiene dentro de las membranas celulares debido a la región de transmembrana existente en la TM nativa. Como consecuencia, la purificación de la proteína requiere del uso de grandes cantidades de detergentes. Además las pequeñas disponibilidades de material a partir de fuentes naturales, impide seriamente el uso de la TM natural en la clínica. En cambio los derivados de TM producidos por la técnica de DNA recombinante se pueden obtener en cantidades no limitadas, son fáciles de preparar y purificar porque se secretan al medio de cultivo y se pueden solubilizar en buffers que no contengan detergentes. Estos derivados de TM poseen características muy útiles para la clínica, pudieran ser usados para el tratamiento y la prevención de trombosis.31

Las trombomodulinas obtenidas a partir de células procariotas pudieran ser usadas para el análisis estructural, sin embargo, para la producción de estos derivados se prefieren las células de mamíferos y de otros hospederos eucariotas, tales como levadura (Saccharomyces, Kluyveromyces, o Pichia), que poseen la maquinaria celular necesaria para el reconocimiento y el procesamiento correcto de la región del péptido señal presente en el aminoterminal del producto expresado. Algunas células hospederas de mamíferos también tienen modificaciones postraduccionales, tales como glicosilación, observada en la TM nativa presente en el plasma.31

Se pueden obtener varios polipéptidos de TM fisiológicamente activos con diferencias en el punto isoeléctrico, en el peso molecular y en la reactividad frente a anticuerpos anticondroitina o antisulfatos de condroitina. Estos derivados de TM pueden ser separados por las diferencias entre las propiedades mencionadas con anterioridad, a través de múltiples pasos de purificación donde se empleen elec-troforesis, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel o cromatografía de afinidad.32

Terapia con derivados de trombomodulina

Se han obtenido derivados de TM con mayor actividad fisiológica y por tanto más efectivo que la TM convencional, por ejemplo la obtención de un polipéptido que presenta carbohidratos unidos covalentemente al esqueleto proteico (condroitina y/o sulfato de condroitina) con acción anticoagulante y antiagregante plaquetario, usado para el tratamiento y la prevención de enfermedades tales como: infarto del miocardio, trombosis, embolismo, obstrucción de vasos sanguíneos periféricos, aterosclerosis obliterante, síndrome de coagulación intravascular diseminada (DIC), angina de pecho, ataque isquémico transiente, toxemia del embarazo, entre otros. Especialmente estos derivados se pudieran emplear cuando dichas enfermedades están en un estado donde es requerido altas actividades fisiológicas del polipéptido en un corto período.32

También se han producido análogos de TM resistentes a la oxidación lo que constituye una ventaja con respecto a la TM nativa cuando se va a emplear en un tratamiento clínico, ya que la misma es susceptible a la oxidación y de este modo pierde su habilidad para promover o activar a la proteína C. Muchas enfermedades requieren del tratamiento con anticoagulantes pues están relacionadas con altos niveles de radicales libres de oxígeno, los cuales pueden inactivar biomoléculas y causar perjuicios tisulares significativos. Ejemplos de estas enfermedades son el daño asociado con el infarto del miocardio, DIC asociado con septicemia, y fibrosis alveolar asociada con síndrome de distress respiratorio en adultos.33

En conclusión las temáticas abordadas en la revisión bibliográfica de la Trombomodulina, nos permiten valorar la importancia de esta glicoproteína de membrana en el mecanismo hemostático. Su mayor mérito radica en la formación del complejo TM-trombina que acelera notablemente la activación de la proteína C mediada por trombina, evento que conduce a la inhibición de la activación de plaquetas y a la formación de fibrina por acción de la trombina. El mecanismo de acción de la TM es uno de los más importantes que operan en el endotelio vascular para mantener el estado anticoagulante normal de la superficie del endotelio. Por otra parte las concentraciones plasmáticas de TM pueden ser un parámetro útil para valorar los daños vasculares causados por procesos inflamatorios o por reacciones de coagulación/fibrinolisis. Esto puede ser objeto de estudio en múltiples investigaciones que posibiliten ampliar los conocimientos básico-clínicos, y el perfeccionamiento de las estrategias de diagnóstico y tratamiento y patologías donde se desarrollen fallas funcionales en el endotelio vascular.

SUMMARY

During the development of thromboatherosclerotic diseases the damages produced in the vascular endothelium are connected with the increase in blood of certain substances considered as markers. Thrombomodulin is one of them and its elevated plasmatic levels may be an indicator of the appearance of functional fails in the vascular endothelium. Some of the aspects that characterize Thrombomodulin are approached in this paper, allowing to keep the profesionals dealing with this thematic informed. The location of this molecule, its isolation and purification, mode of detection, structural and functional characteristics are synthetically reported. Reference is also made to the obtention of derivates of Throbomodulin and to its application in the treatment, as well as to the prevention of thromboatherosclerotic diseases.

Subject headings: THROMBIN; PROTEIN C; MEMBRANE PROTEINS; CHROMATOGRAPHY, ION EXCHANGE; CHROMATOGRAPHY; AFINITY; THROMBOMODULIN.

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