Las comunidades bacterianas. Su rol en la biosfera y el metabolismo. Probióticos y Prebióticos

HONGOS

Investigaciones recientes, basadas en técnicas moleculares, han revelado la gran diversidad y complejidad metabólica de los microorganismos presentes en el mar, en el suelo y en otros organismos. Los microorganismos forman asociaciones complejas que son esenciales para el mantenimiento del equilibrio de la biosfera y de los organismos. Se especula que el conocimiento del metabolismo de bacterias no conocidas hasta el presente permitirá, entre otras posibilidades, el descubrimiento y empleo de nuevas formas de energía. Es interesante destacar que las asociaciones microbianas presentes en el intestino humano desempeñan un papel crucial, tanto en la protección frente a la infección, como en el mantenimiento de funciones esenciales para la salud. El agregado de agentes conocidos como probióticos, es decir, bacterias con efecto benefico, y prebióticos, alimentos o substancias que promueven el crecimiento de estas bacterias, ayudan a modular la composición de la icroflora intestinal.

  • COMPLEJIDAD Y ROL DE LAS ASOCIACIONES BACTERIANAS

 

Un enorme porcentaje de los seres vivos esta constituido por bacterias. Los microbios son los organismos más antiguos del planeta. Su origen se estima en alrededor de 4 mil millones de años.

A pesar de su tamaño microscópico constituyen una parte altamente significativa de la masa de los seres vivos (biomasa) que constituye nuestra biosfera.

Los estudios con los microorganismos son particularmente útiles para el abordaje de temas complejos como la biodiversidad y la evolución. Además, el descubrimiento y conocimiento de nuevas especies de bacterias y nuevos metabolismos podrá resultar de gran importancia desde el punto de vista del conocimiento básico y de sus aplicaciones.

Decenas de miles de especies bacterianas están representadas en el Gen Bank, donde se inscriben las secuencias de nucleótidos de los organismos, resultantes del análisis parcial o total de sus genomas. Sin embargo éstas serían sólo una pequeña fracción de las especies existentes. Estimaciones reciente sugieren que el mar podría albergar alrededor de 10 millones de especies bacterianas diferentes, y que una tonelada de suelo podría contener unos 4 millones de tipos de bacterias. Sólo el intestino humano contiene en promedio 1.2 kg de bacterias. Nuevos grupos de bacterias continúan descubriéndose permanentemente en la cavidad bucal.

Se estima que el 99% de las bacterias no han sido aún cultivadas en el laboratorio. Muchas bacterias no son pasibles de ser cultivadas en el laboratorio como monocultivos (cultivo de una sola cepa aislada) pues están adaptadas a crecer en ciertos ambientes como parte de una comunidad más compleja.

La determinación de la diversidad bacteriana se lleva a cabo mediante el empleo de técnicas de biología molecular. De este modo se obvia la necesidad de aislar cada tipo de organismo. Una de las técnicas empleadas es PCR (por “polymerase chain reaction”), que consiste en la amplificación por la enzima ADN polimerasa de genes o fragmentos de genes, en este caso a los correspondientes al ARN ribosomal ( rARN), en particular el ARN de 16s, de muestras de ADN provenientes de un determinado habitat (Esquema 1).  El rARN se considera una moléculas tipo cronómetro, que sirve para medir cambios evolutivos, y ha sido empleada para el análisis filogenético de las bacterias. Las secuencias obtenidas se comparan con otras secuencias conocidas y si no muestran grandes similitudes se consideran como pertenecientes a un nuevo organismo.

Nuevos enfoques técnicos se aplican a la detección de bacterias en mezclas complejas, como el secuenciamento de fragmentos genómicos obtenidos por rotura al azar del ADN proveniente de mezclas de poblaciones de bacterias, método denominado de perdigonado («shotgun»). (Esquema 1). El análisis computacional de las secuencias su perpuestas o solapadas («overlapping») de los extremos de los fragmentos posibilita la configuración de un genoma. Además, una nueva secuencia, aun que parcial, permite evidenciar la presencia de genes no conocidos.

Estudios realizados con este enfoque sobre biofilms formados en el drenaje ácido de una mina permitió conocer los genomas casi completos de algunas bacterias capaces de crecer en estos ambientes extremos (denominadas extremófilas).

Este método fue aplicado por Craig Venter (The Institute for Biological Energy Alternatives, IBEA, Rockville, Maryland) *para el estudio de muestras de bacterias extraídas del Mar de los Sargazos, una región del Océano Atlántico cercana a la península de Florida. (C. Venter fue director de uno de los dos equipos de trabajo que generaron la primera versión de la secuencia completa del genoma humano). El Mar de los Sargazos fue elegido porque,  dado su bajo contenido en nutrientes, se estimó contendría un bajo número de especies. Debido a que la mayoría de las bacterias marinas no crecen en el laboratorio, una manera de detectarlas se basa en el secuenciamiento de las muestras de ADN extraídas del mar. Los estudios realizados, que involucraron el secuenciamiento y análisis de un billón (1012) de pares de bases, permitieron identificar más de un millón de genes desconocidos hasta el presente, y se detectaron nuevos genes, unos 700, con secuencias atribuibles a nuevos tipos de foto-receptores (substancias capaces de captar la luz y de convertirla en señales electroquimicas, esto es, nuevas formas de energia)**. Se ha afirmado que habría una información genética tan particular e interesante en un litro de agua de mar como en el genoma humano.

La complejidad de este tipo de estudio es mucho mayor que la del genoma humano por cuanto hay muchas especies involucradas y su frecuencia puede variar, con el muestreo, en el espacio y en el tiempo.

C. Venter considera que estos estudios podrían evidenciar nuevas formas de metabolismo cuyo conocimiento posibilite la generación de formas alternativas de energía con la utilización de la luz solar, por ejemplo por producción de hidrógeno.
Esquema 1

Secuenciamento genómico (método de perdigonado o «shotgun»)

A. Fragmentación al azar del ADN genómico en segmentos de varios miles de bases de longitud.

B. Secuenciamiento de las bases de estos segmentos.

C. Ensamble de estos segmentos en función de las secuencias con solapamiento («overlapping») mediante el empleo de programas computacionales (bioinformática).

Secuenciamiento del ARN ribosomal de 16s (16s rARN)

A. Amplificación por PCR de los genes correspondientes al ARN de 16s.

B. Secuenciamiento de la secuencias amplificadas.

C. Análisis comparativo de estas secuencias

 

 

  • INTERACCIONES BACTERIA-ORGANISMO

 

Claire Fraser (The Institute for Genomic Research (TIGR), Rockville, Maryland) y sus colaboradores y la Universidad de Stanford, California, tienen el proyecto de aplicar la misma técnica de análisis del ADN (método de perdigonado o»shotgun») empleada para el secuenciamiento del genoma humano y de la flora bacteriana del Mar de los Sargazos, para conocer la flora que habita nuestras cavidades bucales. Un análisis similar se llevará a cabo para el estudio de la flora intestinal y de la vagina.

Existirían al menos 500 especies de bacterias que viven en el intestino humano, alrededor de 500 en la cavidad bucal, y otras 500 en la vagina.

Figura 1

 

Aunque parezca increíble aproximadamente el 95% del total de las células de nuestro organismo son bacterias, las que se encuentran localizadas fundamentalmente en el intestino grueso! Habitan nuestro colon alrededor de 1012 (1 billón) microorganismos por ml.

Estudios realizados con el ADN extraído de placas bacterianas formadas sobre dientes o encías revelaron que más del 40% de las secuencias nucleotídicas encontradas no habían sido descriptas previamente.

Mediante el estudio y comparación de las secuencias de ARN de 16s de la flora intestinal se concluyó que en nuestro intestino somos portadores de varios centenares de bacterias, y ademas habria diferencias en el contenido de especies entre persona y persona. No habría dos personas que lleven el mismo complemento de bacterias. Esta flora se establece al azar en cada persona a partir del nacimiento y se mantiene prácticamente estable durante toda la vida. La flora se iría modificando luego de los 60 años de edad.

Las asociaciones de bacterias que habitan nuestros intestinos se consideran vitales: a) para ayudar en la digestión b) para excluir bacterias patógenas.

¿Cuáles son las bacterias que habitan nuestros intestinos? ¿Algunas especies de bacterias podrían predisponernos a ciertas enfermedades como el cancer de colon? ¿Se puede modificar nuestra flora intestinal?

Se conoce que las bacterias intestinales ayudan en la digestión por hidrólisis de las fibras, enzimas y otras proteínas. Bacterias tales como BifidobacteriumLactobacillus y Eubacterias, involucradas en reacciones de fermentación, producen ácidos orgánicos que son absorbidos y utilizados como fuente de energía. Y es probable que muchos otros microorganismos, aún desconocidos por nosotros, sean nuestros mejores aliados.

Otras bacterias pueden tener efectos no deseables, como las del género Clostridium, que generan nitrosaminas y cresoles que podrían tener posibles efectos carcinogénicos.

Existe un importante efecto de sinergismo entre las bacterias intestinales y el organismo huésped. Un interesante ejemplo de ello lo constituyen los resultados de estudios realizados por J. Gordon y col. (Washington University, School of Medicine, St. Louis, Mo.,USA) en ratones recién nacidos, en los que se demostró que una bacteria anaeróbica Bacteroides thetaiotaomicron controla la síntesis por las células del intestino de una proteína, angiogenina 4 (ang4), que es esencial para la formación de los vasos sanguíneos y que es además un potente agente antimicrobiano. Mata a bacterias patógenas como Listeria monocytogenes, Streptococcus pneumoniae Enterococcus faecalis y hongos patógenos como Candida albicans sin afectar otros residentes del intestino, como E. coli.

Las bacterias cuentan con mecanismos de señales, designadas autoinductores, que les permiten sensar su número o densidad e inducir una serie de funciones. En un trabajo reciente se demuestra que dos moléculas señal de este tipo, derivadas de la molécula homoserin-lactona, producidas por la bacteria patógena Pseudomonas aeruginosa, pueden modular también la expresión génica en las células huésped. De manera tal que estas señales no sólo son reconocidas por las bacterias, sino que penetran y funcionan en las células eucariotas.

Gordon y sus colaboradores comenzaron a estudiar la microbiota intestinal del pez-cebra (“Zebrafish” o Danio rerio), un pececillo muy estudiado por los genetistas. Cuando este pez se hace crecer libre de gérmenes tiene problemas en la utilización de nutrientes, en la renovación del epitelio intestinal y en la destoxificación de sustancias dañinas. La microbiota intestinal regula la expresión de 212 genes del pez!. Curiosamente, 59 de estos genes son análogos a genes regulados por bacterias en el intestino del ratón. Es muy interesante la similitud observada en las respuestas del pez-cebra y del ratón a la microbiota intestinal, dadas las distancias evolutivas y la diferente composición de las floras microbianas de ambos organismos.

  • PROBIÓTICOS Y PREBIÓTICOS

Los antibióticos, la dieta y el estrés son factores que alteran el equilibrio bacteriano intestinal provocando inflamación, gases y diarrea. Este equilibrio es importante y es poco lo que sabemos sobre él.

Varios equipos de trabajo estudian el tipo de alteraciones que ocurren al nivel de la flora microbiana intestinal y el potencial efecto benéfico que ejerce sobre ella la ingesta de cierto tipo de bacterias y sustancias. Las bacterias con efecto benéfico se denominan probióticos y los ingredientes alimentarios que promueven su crecimiento en el intestino se denominan prebióticos. Los productos que contienen probóticos y prebióticos se denominan simbióticos. En el esquema 2 se presenta un listado de los probióticos y prebióticos más empleados.

Esquema 2

  Los prebióticos y probióticos en uso en el mundo, particularmente en Japón, donde los primeros constituyen un mercado altamente desarrollado, son:

Prebióticos

 

Inulina
Fructo-oligosacárido (FOS)
Galacto-oligosacárido (GOS)
Oligosacáridos de la soja
Gluco-oligosacáridos
Polidextrosa
Lactulosa
Lactosucrosa
Xilo-oligosacáridos
Isomalto-oligosacáridos

 

Probiótico

 

Lactobacilus casei
L. acidophylus
L. fermentun 
L. johnsonii 
L. plantarum 
L. rhamnosus 
L. rhamnosus GG 
Bifidobacterium longum 
B. infantis
B. bifdum
Lactococus
Estreptococos
Especies de Saccharomyces
Escherichia coli Nissle

 

Los probióticos se emplean hace ya 40 años en Europa, USA y Japón, en la alimentación de animalesde granja habiendose observado disminución del riesgo de infección, aumento en el rendimiento alimentario y mejoramiento de la producción (huevos, carne, leche). Su aplicación como aditamento alimentario ha cobrado mayor importancia como reemplazo del empleo de los antibióticos, dados los serios problemas sanitarios derivados de la aparición de cepas bacterianas con resistencias múltiples a los mismos.

 

Las bacterias probióticas, tales como ciertos tipos de lactobacilos o bifidobacterias se agregan a yogures y a otros tipos de alimentos.

La comercialización de este tipo de productos, en forma de alimentos fermentados, alimentos suplementados y preparados farmaceúticos, mueve en el mundo un volumen considerable de recursos. Además, este mercado presenta perspectivas futuras muy promisorias.

En la ciudad de Tucumán funciona el CERELA (Centro de Estudio de Referencia de Lactobacilos), Instituto de CONICET, que se dedica al estudio de las bacterias lácticas. En esta institución se han desarrollado y patentado productos fermentados probióticos, como la leche Bio, y se encuentran en proceso de desarrollo nuevos productos probióticos a ser obtenidos por fermentación láctica de la leche de soja, con el objeto de conseguir un producto más digerible y nutritivo.

Si bien existen numerosas evidencias sobre el efecto de los probióticos, éstas no siempre son absolutamente rigurosas y muchas veces no se conoce exactamente su mecanismo.

La leche humana contiene una mezcla compleja de glucoproteínas y oligosacáridos que estimulan a las bifidobacterias, que tienen propiedades inhibitorias contra varios patógenos intestinales. Este efecto explicaría las bondades atribuídas a la alimentación de los bebes con la leche materna.

Un estudio realizado con bebes recién nacidos, de madres provenientes de familias con antecedentes de alergias, y que fueron tratados diariamente con Lactobacillus rhamnosus durante 6 meses permitió demostrar que éstos fueron menos propensos a desarrollar reacciones alérgicas que los controles que no tuvieron este tratamiento.

Aproximadamente dos tercios de la población humana adulta muestra intolerancia al azúcar lactosa, presente en la leche, con prevalencia en lugares de Africa, Asia, y en Sicilia en Europa. Las personas que sufren este problema toleran mejor la lactosa presente en el yogur, que en la leche. Una explicación para ello es que el yogur y las bacterias lácticas presentes en él poseen niveles más altos de lactasa, enzima que hidroliza la lactosa (en glucosa y galactosa).

Los prebióticos son un tipo de azúcares, oligosacáridos, no digeribles, que estimulan el crecimientos de ciertos microorganismos con efectos benéficos sobre su huésped.

Para calificar como prebiótico un ingrediente alimenticio debe tener las siguientes propiedades:

1) ser estable bajo las condiciones acídicas del estómago y frente a las secreciones del intestino delgado; 2) transferirse intacto lectivo para ciertos géneros de bacterias considerados como beneficiosas, tales como bifidobacterias y lactobacilos. Una serie de efectos sobre la salud se encuentran asociados con la ingesta de prebióticos, aunque algunos no han sido rigurosamente comprobados y en otros muchos casos los mecanismos se desconocen. Los prebióticos podrían interferir con mensajes enviados por patógenos y actuar así como agentes anti-infecciosos.

Los alimentos como cebollas, ajos, espárragos, leche y bananas, entre otros, contienen prebióticos naturales.

Glenn Gibson, gastroenterólogo de la Universidad de Reading (Reino Unido) estudia las bacterias intestinales para conocer mejor este ecosistema, y para poder evaluar, entre otros, el efecto de los probióticos y prebióticos sobre el mismo. Para ello instaló en su laboratorio sistemas de tubos y frascos que representan diferentes secciones del colon de infantes y adultos, normales y con distintas enfermedades (colon irritable, colitis ulcerosa o cancer), que sembró con mezclas conocidas de microorganismos. Cada sistema fue provisto, a través de «una boca», de alimentos, de probióticos y de prebióticos. Se consiguió así controlar artificialmente la velocidad del tránsito del alimento, e inducir la simulación de diarreas o constipación.

Gibson y sus colaboradores se encuentran estudiando el efecto del agregado de organismos probióticos como Lactobacillus plantarum, con el de un azúcar prebiótico, a situaciones similares a las de varios tipos de enfermedades intestinales inflamatorias, con el objeto de determinar su efecto sobre la microbiota.

Se espera que el empleo conjunto de sistemas in vitro y de modelos animales para el estudio de la flora intestinal y sus modificaciones, y la aplicación de metodologías moleculares, permita conocer mejor los eventos que ocurren en el interior de nuestro tubo digestivo y mejorar el diagnóstico de sus enfermedades. Ello posibilitará optimizar el empleo de probióticos y prebióticos y favorecerá el desarrollo de nuevos productos simbióticos que actúen más específicamente sobre los agentes causales.

 

Notas

* The Institute for Biological Energy Alternatives (IBEA) se fusionó con otros dos institutos, The Center for the Advancement of Genomics (TCAG) y J.Craig Venter Instittute Science Foundation Joint Technology Center (JTC), formando el actualmente denominado J.Craig Venter Institute (JCVI).

** El estudio realizado por JCVI en el Mar de los Sargazos fue extendido entre agosto de 2003 y mayo de 2004 a las comunidades microbianas del NO del Atlántico y la zona tropical E del Océano Pacífico (Sorcerer II Global Ocean Sampling Expeditions, GOS). Los datos y resultados comenzaron a publicarse en marzo de 2007 (http:// collections.plos.org/plosbiology/gos2007.php). Se realizaron 7.7 millones de secuenciamientos que totalizaron 6.3 millones de pares de bases (el doble que los del genoma humano). De estos datos se concluye la existencia de 6 millones de nuevas proteínas, miles de quinasas diferentes y gran variedad de proteorodopsinas (sustancias captadoras de luz).

 

GLOSARIO

ADN: molécula portadora de la información genética constituída por una cadena lineal de nucleótidos (que llevan el azúcar desoxiribosa).

Aminoácido: unidad de la cadena polipeptídica constituída por un ácido orgánico con uno más grupos amino.

ARN: cadena lineal de nucléotidos (que llevan el azúcar ribosa).

Bases: purinas (guanina, G y adenina, A) y pirimidinas (timina, T y citosina, C), cuya secuencia en la molécula de ADN determina la información genética de un organismo.

Biofilm: asociación de bacterias de un mismo tipo o de diferentes microorganismos, que forma una película sobre ciertas superficies, y que adquiere propiedades distintivas, como por ej.mayor resistencia a antibióticos.

Eucariota: seres vivos que tienen nucleo diferenciado, por oposicion a bacterias, que no lo tienen.

Fotoreceptor: receptor que responde a un estímulo lumínico.

Gen: segmento de ADN que codifica un polipéptido.

Genoma: conjunto de la información genética de un organismo determinado por la secuencia de bases en el ADN.  Glicoproteina: proteina que contiene ademas grupos glicosidicos (azucares).

Microbiota: conjunto de bacterias que viven en un determinado recinto.

Monosacáridos: polialcoholes que contienen un grupo aldehído o cetónico y llevan 3 o más átomos de carbono y que constituyen la unidad (en general con 5 o 6 atomos de carbono) de los oligo- o polisacáridos.

Oligosacárido: monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos que contiene un número pequeño (2 aaproximadamente 20) de residuos o unidades.

Organela:pequeña estructura organizada, dentro de la celula.

Nucleótido: unidad constituyente de los ácidos nucleicos que lleva un azúcar (ribosa o desoxiribosa), una base (citosina, guanina, timina o guanina) y un grupo fosfato.

Ribosoma: organela constituída por ARN y proteínas, sitio de la biosíntesis de proteínas. En bacterias ésta formada por la subunidad de 30s (lleva el ARN de 16s) y la subunidad de 50s (lleva ARNs de 23s y de 5s).

PCR: («polymerase chain reaction») reacción de amplificación de una secuencia nucleotídica por acción de la ADN polimerasa.

Polipéptido o proteína: secuencia lineal de aminoácidos unidos por uniones peptídicas. s:  (de Svedbrg, el inventor de la ultracentrifuga ) unidad de la velocidad de sedimentacion de una molecula de gran tamaño.

BIBLIOGRAFÍA
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-Sitios de internet con información actualizada sobre probióticos y prebióticos:

ww.issap.net; www.vtt.fi/virtual/proeuhealt

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