Avances en metabolómica nutricional

En el marco de la Jornada Nutrigenómica y Metabolómica nutricional organizada por el Instituto Tomás Pascual Sanz en colaboración con la Real Academia Nacional de Farmacia y el Colegio Oficial de Farmacéuticos de Madrid, Dña. Isabel Bondía Pons pronunció la ponencia Avances en Metabolómica nutricional.

Definiciones

La metabolómica nutricional es la disciplina -ómica que estudia como la dieta afecta a nuestro metabolismo.

Según la Sociedad Internacional de Metabolómica se define como el estudio de la respuesta metabólica dinámica y multiparamétrica de un sistema vivo a un estímulo fisiopatológico, un cambio ambiental o una modificación genética (dinámica porque nuestro metabolismo está en constante cambio y multiparamétrica porque nuestro metabolismo depende de múltiples factores). Si el estímulo es un cambio ambiental, un cambio en la dieta, propiamente hablamos de metabolómica nutricional.

Los factores que influyen en el metaboloma se clasifican en factores intrínsecos o innatos al individuo como la composición corporal, genotipo, edad, sexo, nuestro estado reproductivo; y factores extrínsecos como los nutrientes y no nutrientes provenientes de nuestra dieta, la actividad física, la flora colónica, los medicamentos, etc.

Y la última definición de metabolómica es muy sencilla: es la ciencia que estudia el metaboloma y esto es el conjunto de metabolitos endógenos y exógenos de bajo PM (<1000 Da) presentes en un sistema biológico (célula, tejido, órgano, organismo, o especie). A diferencia de la proteómica que busca macromoléculas.

Caracterización del perfil metabólico («metabolite profiling»)

Hay dos enfoques: dirigido o no dirigido. El dirigido consiste en analizar un grupo de metabolitos relacionados con una ruta metabólica específica o con una familia química determinada. Actualmente el enfoque que más se utiliza, con más potencial, es el no dirigido, que se basa en comparar patrones de metabolitos («fingerprints» o «huellas metabólicas») que cambian en respuesta a una enfermedad, un cambio ambiental (dieta) o una alteración genética.

Utilidad de la metabolómica. Nuevos biomarcadores

La metabolómica es una herramienta muy poderosa para analizar nuevos biomarcadores. Éstos pueden ser:

-De ingesta, que es útil para los nutricionistas para saber si realmente los pacientes están siguiendo la dieta recomendada, para evitar la subjetividad de los cuestionarios de frecuencia alimentaria.

-Biomarcadores del efecto de una intervención nutricional en la salud. Por ejemplo en los países nórdicos se suele consumir mucho pan de centeno en lugar de trigo y se ha visto en estudios epidemiológicos que el pan de centeno puede ser beneficioso en el metabolismo de la insulina. En nuestro grupo nos dedicamos a buscar lo que llamamos la «huella del centeno», los metabolitos que por la ingesta de pan de centeno pueden provocar cambios en las rutas metabólicas relacionadas con el metabolismo de la insulina.

-Biomarcadores de diagnóstico precoz de enfermedades: se puede mostrar la variación en el tiempo del perfil metabólico de un biomarcador hipotético con su variabilidad desde el estado de homeostasis hasta el estado de enfermedad. Si conseguimos analizar el cambio del perfil metabólico en el punto donde pasamos del estado de salud al patológico posiblemente podremos intervenir de una forma temprana con intervenciones nutricionales -ayudadas de una buena práctica de actividad física- para volver al estado de salud, y no necesitar tratamiento farmacológico para paliar los síntomas de la enfermedad.

Metaboloma humano

El metaboloma humano se compone del metaboloma endógeno y exógeno. Éste a su vez se compone del metaboloma del alimento (que proviene de la ingesta de la dieta), del metaboloma microbiano de nuestra flora intestinal y del xenometaboloma que se debe a todos los metabolitos que proceden de los medicamentos que tomamos. Y la dieta es la suma de muchos alimentos con composiciones químicas diferentes.

La metabolómica nutricional intenta ver el efecto que producen ciertos alimentos, por ejemplo un alimento funcional, en nuestro metaboloma endógeno. Y hay que tener en cuenta que el alimento antes de entrar en el cuerpo ya sufre multitud de transformaciones químicas y después la transformaciones una vez digerido. Y todo esto afecta al metaboloma endógeno.

Etapas del estudio metabolómico

Un estudio metabolómico requiere un cuidadoso diseño experimental debido a que existe una elevada variación bioquímica inter-individual que se puede reducir a través de la conducción de estudios de intervención controlados (diseño doble-cruzado, ya que el propio individuo es a su vez control).

Este tipo de análisis requiere un número de voluntarios elevado por grupo. Y también hay que acotar los criterios de inclusión y exclusión de los participantes. Por ejemplo si queremos evitar cofactores debidos al ciclo biológico, escogeremos hombres en lugar de mujeres.

Después del reclutamiento de los individuos y de haberles sometido a una actuación nutricional, se recogen muestras y se analizan en plataformas metabólicas que generan una cantidad enorme de datos que requieren de un procesado estadístico especial. Y tras ello, se procede a la identificación de los metabolitos considerados como marcadores y la última etapa es interpretar los efectos de ellos en el contexto biológico.

Los fluidos analizados son la sangre (suero o plasma) y la orina. Los estudios con plasma reflejan mejor los metabolitos endógenos del impacto de la intervención nutricional de la dieta. En cambio los estudios en los que se analiza la orina se tiene más idea de los metabolitos exógenos. Actualmente se intentan combinar ambos tipos de muestras. También se pueden estudiar saliva, heces o tejidos.

Plataformas metabolómicas

Las muestras se analizan con unas plataformas metabolómicas que se basan en las técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) y de espectrometría de masas (MS) acoplada o no a las técnicas cromatográficas.

Las técnicas que actualmente estamos utilizando sólo han conseguido identificar una parte ínfima -aunque considerable- de nuestro metaboloma. Por tanto nos queda mucho trabajo por hacer.

Nuestro grupo trabaja con espectrometría de masa detectando iones que se caracterizan por su tiempo de retención, masa exacta e intensidad. Estos análisis generan una lista considerable de iones que son trasportados a softwares estadísticos para su procesado. Antes hay varias etapas, lo que llamamos preprocesing, es el filtrado de cromatogramas, de normalización (hay mucho trabajo para limpiar los datos antes de analizarlos).

Después aplicamos el análisis estadístico multivariante que puede ser realizado por métodos no supervisados o supervisados. En los métodos no supervisados se desconoce a priori la clasificación de las muestras según el grupo de intervención (tratamiento) al que pertenecen. Y la técnica más utilizada es el análisis por componentes principales (PCA). En cambio en los métodos supervisados ya sabemos a que grupo corresponde cada muestra. Los modelos requieren ser validados cuidadosamente antes de ser aplicados.

En el PCA se generan dos gráficas. Una primera denominadascores plot que explica la variabilidad de las muestras en función de los grupos de intervención sin saber que estas muestras corresponden a las personas que han consumido el té negro o el té verde. El análisis ya percibe una diferenciación entre grupos debido a los metabolitos. Y después de realizarse esta separación inicial se crea elloading plot que da idea de cuales son los iones que pueden justificar esta separación. En muchos casos los iones no están identificados y se ha de pasar a analizar y cuantificar esos metabolitos.

¿Cómo se realiza la identificación de marcadores? Para ello contamos con herramientas de composición elemental (calcula fórmulas moleculares en base a la masa exacta de los iones). Pero básicamente lo que hacemos es comparar los datos de nuestros análisis con datos que se han incorporado a bases de datos abiertas (pj la Human Metabolome Data Base, que ofrece en la actualidad 5000 metabolitos). Una vez sugerimos la estructura del biomarcador se pasa a analizados por tandem MS fragmentando el compuesto para confirmar su estructura.

En un ejemplo de la Human Metabolome Data Base después del análisis estadístico y de ver en el loading plot que un determinado ion es posiblemente un marcador potencial del efecto de la intervención nutricional, se marca y se buscan aquellos metabolitos que se ajustan con su masa exacta, pero ¡vean la cantidad de opciones que nos dan -con una masa de 4 decimales-!. Por tanto necesitamos equipos con mucha sensibilidad para poder diferenciar entre metabolitos de una misma familia.

Una vez identificados los biomarcadores hay que interpretar biológicamente su papel en el cuerpo, para insertar estos nuevos biomarcadores en las rutas metabólicas y ver si la intervención nutricional ha causado algún efecto o se buscan nuevas rutas. Esta etapa, que es la más importante, todavía queda muy lejana.

Estudios metabolómicos nutricionales

Ejemplo 1

¿Se pueden encontrar cambios en el perfil metabólico de los individuos tras la ingesta de alimentos que pertenecen a una misma familia? Este estudio se basó en comparar los efectos de la ingesta de té negro y té verde.

Se trata de un estudio de dos días por tres tratamientos. Durante 2 días cada individuo tomaba 1 g té/d (10 tazas de té). El primer día es de wash out en el que se le da al individuo una dieta baja en polifenoles (sin té) y el segundo día consume el gramo de té. Después pasan 10 días dewash out en los que consumen su dieta habitual y vuelven a someterse a otros dos días con el segundo tratamiento (el otro té). Y el tercer tratamiento, el grupo control, se realiza dándole 360 mg de cafeína que es la cantidad de cafeína que se presenta en un gramo de té.

Al principio y la final de todos los días de intervención se recogen muestras de orina de 24 horas y plasma, y se analizaron por RMN.

Se consiguió diferenciar todas las muestras en función del tratamiento escogido y se obtuvieron cambios en metabolitos exógenos dependiendo del té que se consume. Se vio un aumento en la excreción urinaria de ácido hipúrico y de 1,3-diOHfenil-2-O-sulfato (productos finales del metabolismo de flavonoides del té por la flora microbiana). Este aumento se vio en el té negro y en el verde. Pero una gran variedad de metabolitos aromáticos que no se identificaron se detectaron específicamente en el té verde.

Pero también se vieron cambios en metabolitos endógenos. El resultado más impactante fue que el té verde mostró un aumento más pronunciado de la excreción de varios metabolitos intermediarios del ciclo de Krebs y esto llevó a la conclusión de que hay un efecto específico de los flavanoles del té verde en el metabolismo energético oxidativo humano que no se muestra con el té negro.

Ejemplo 2

En un estudio pionero sobre las preferencias alimentarias se planteó la pregunta: ¿se pueden diferenciar individuos por su perfil metabólico en base a sus preferencias alimentarias?

Se reclutaron 22 varones sanos y antes de someterlos a una intervención nutricional se les pidió que rellenaran un cuestionario de frecuencia alimentaria. Y en base a ello se pudieron clasificar en individuos con gran deseo de comer chocolate o con indiferencia a comer chocolate.

El primer día se hizo un wash out con una dieta baja en polifenoles (chocolate) y el segundo día se dio a la mitad de los individuos 50 gramos de chocolate. La otra mitad de individuos tomó placebo -50 gramos de pan-. Entre ambas intervenciones hubo un día de wash out.

Los resultados mostraron que el grupo que se clasificó desde buen principio como deseoso de comer chocolate tenía unas concentraciones más bajas de LDL y más elevadas de albúmina, pero esto no se debió a la estimulación con los 50 gr de chocolate porque este perfil metabólico ya se observó antes de someterlos a la intervención con el chocolate, por lo que se cree que las preferencias alimentarias que tenemos modifican de alguna manera nuestro perfil metabólico.

El estudio también encontró diferencias en los metabolitos procedentes de la flora microbiana en ambos grupos. Y ¿qué consecuencias tiene para la salud a largo plazo? Esto es lo que actualmente se está estudiando.

Conclusión

La metabolómica es una herramienta objetiva para estudiar los cambios metabólicos causados por acción de la dieta a través de la identificación de nuevos marcadores en forma de perfiles metabólicos.

Dña. Isabel Bondía Pons, Investigadora postdoctoral. Colaboradora investigadora Universidad de Navarra. Departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología (CAFT)

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